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Millipore的Amicon®Ultra超滤管的使用方法

更新时间:2023-11-15 浏览次数:936

 默克 Millipore Amicon® Ultra 离心式超滤管因其wan美的设计一经推出即成为生物样品操作的产品。不论是蛋白、核酸、病毒或颗粒物,抑或低浓度样品或宝贵的活性样品,Amicon® Ultra 都能兼顾高回收率和操作的方便性及标准化,并满足下游各种应用的要求,使研究者处理样品时倍感轻松。但是,在默克生命科学团队推出超滤管中文说明书(AU0.5/4/15)之前,我们发现近90%的使用者在选择和使用过程中因为缺乏必要信息而没有获得最佳体验,更重要的是,宝贵的样本会遭受本可避免的损失!



选对截留分子量,事半功倍

如果目的蛋白是120kDa,请问应该选择的超滤管规格是100k,50k,还是30k甚至10k?你采用的是1/2,1/3抑或1/6算法?这些没有统一的说法,是因为不同厂家的膜的截留分子量的定义不同。Millipore的超滤管采用其有的再生纤维素膜,定义为:一个确定NMWL 的超滤膜应该截留至少90% 以上的这个大小的球形分子,即100kDa的球形蛋白用100k的Ultracel®再生纤维素膜得率超过90%。请仔细查看以下默克生命科学数据:

(以0.5mL的AU0.5为例,其它型号截留分子量的选择原则一致,具体离心力和离心时间不同。)


截留分子量选小啦!看到这个表,你是否发现原来抱怨Millipore超滤管流速偏慢的根源来自对于Millipore截留分子量定义的误解。膜孔径要小于目的分子这是第一原则。如果分子有近似球形的立体结构(而非明显的线性分子),在Millipore再生纤维素超滤膜体系内,选择“等于"或“略小于"目的分子的截留分子量的超滤管是zui选择,这样操作起来又快又好,既保证了样品回收率,又缩短了离心时间,大幅降低大分子损伤风险。


Amicon® Ultra系列超滤管产品需要根据起始样品体积、目标蛋白或核酸的分子量、终体积及浓缩倍数等选择具体型号。下表为选择适合截留分子量的超滤管提供了一些参考建议


收取体积已经很小的浓缩好的样品时,你会:

购买最尖细的枪头,把样品吸回来 

浓缩倍数低一点,以便用枪头把样品吸回来

反转离心回收,获得最高得率

正确答案“C",你答对了么?
Millipore的Amicon® Ultra系列超滤管上样体积有0.5/2/4/15/70mL等五种,除了采用低吸附的管材和低蛋白吸附的再生纤维素超滤膜,其中0.5mL,2mL和70mL的规格还特别设计了反转回收模式,以便使已经浓缩的样品回收。


现在你总该知道为什么收到AU0.5的时候会有两个外管了吧~


更多关于超滤管的正确使用问题:

  • 蛋白在浓缩时出现了沉淀,如何改进?

    蛋白如果浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的最终浓度不超过20mg/ml。对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白,建议的改进方法是:

    1)离心力降为推荐离心力的30%-50%

    2)改用截留分子量更大的超滤管(如原本选用10k,此时可以选择30k) 

    3)在浓缩过程中取出超滤管,用枪头反复吹吸几次后再继续浓缩

    4)体积较大的样品可考虑选用搅拌式超滤杯,减少沉淀的发生

  • Amicon® Ultra超滤管可以用酒精消毒灭菌么?

    Amicon® Ultra与70%乙醇是兼容的,但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试,所以无法提供更进一步的参考信息。建议采用Ultrafree无菌离心管对浓缩后的样品进行过滤除菌。

  • Amicon® Ultra超滤装置是否可以用于高压灭菌?

    Amicon® Ultra都是采用热封设计,不可以用高压高温灭菌。

  • 怀疑浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附,如何改善? 

    Amicon® Ultra超滤管使用的是再生纤维素膜,这种材质是蛋白吸附的超滤膜。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白,它们和膜的非特异吸附可能会增强。对于这种情况,可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理,也可以尝试换成Amicon® Ultra 0.52来进行实验,通过减小膜面积来降低非特异性吸附。

  • 有时候用超滤离心管连水都离不下来,可能是什么原因?

    Amicon® Ultra超滤膜中含有微量甘油。如果出现这种情况,请先用0.1 N NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用,如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。

  • 如果要用超滤的方法分离两种蛋白,那么这两个蛋白的大小需要相差多少?

    按照经验,建议两个蛋白的分子量要相差一个数量级(10倍)。

  • 说明书中推荐在室温下进行离心,考虑到蛋白的稳定性,是否可以在4℃进行离心?

    可以,但是低温会增加蛋白样品的粘性,导致流速减慢,建议可将离心时间延长到原来的1.5倍。

  • 浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白,可能的原因有哪些?

    首先,Amicon® Ultra超滤管的蛋白zui低起始浓度为25ug/ml。请确保样本的起始浓度大于这个浓度。其次,如果问题仍然出现,请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因:

    1)如果目的样本在滤过液中,那么请排查:

      a) 是否选择了合适截留分子量的超滤管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?

      b)使用的离心力是否是在限定范围内?如果使用的是rpm,请换算成相应的g离心力,具体换算方法请垂询。

      c)离心机最近是否有校准过?

      d)是否尝试这个蛋白?如果能确保用同样的超滤管对其它蛋白成功操作的话,那么有可能是这个目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性(构象差异)而影响浓缩效果,建议选用更小截留分子量的超滤管(如原本选用30k,此时可以选择10k)

    2)如果目的样本也不在滤过液中,那么:

      a)蛋白样本起始浓度是否大于25ug/mL?

      b)用来确定样本浓度的方法是什么?是否可信?

      c)目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀问题的解释。

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